本文原题“一种新型配方实现了将3种HIV药物替诺福韦-拉米夫定-多替拉韦从短效转化为长效一体化注射剂”，作者为Simone Perazzolo等人。文章2023年11月15日发布在《AIDS》上，《AIDS》被认为是在HIV/AIDS研究领域内最重要的期刊之一，为医生、研究人员和公共卫生专业人士提供了关于最新科学发现和治疗实践的重要信息。
本文主要介绍了一种名为TLD-in-DcNP的新型HIV药物配方，它能将原本需要每天服用的短效HIV药物转换为长效注射形式。这种配方结合了替诺福韦、拉米夫定和多替拉韦三种药物，并利用了药物组合纳米颗粒（DcNP）技术，以增强药物在体内的稳定性和持续时间。
研究表明，TLD-in-DcNP能在体内保持较长时间的药效，且对于同时感染HIV和HBV（乙型肝炎病毒）的患者也有潜在的治疗效果。这一发现为HIV治疗领域带来了新的可能性，有望显著改善HIV患者的生活质量。
研究目的：我们致力于将日常口服的HIV药物——替诺福韦、拉米夫定和多替拉韦——转化为一种注射剂，目标是创造一个集三种药物于一体的长效治疗方案。
研究设计：利用药物组合纳米颗粒技术，我们成功稳定了这三种药物，并将它们与脂质辅料结合，形成了新型的TLD-in-DcNP。经过测试，这种新配方不仅稳定，而且适合通过皮下注射给药。通过对非人类灵长类动物的实验，我们详细记录了三种药物在血浆和PBMC中的浓度变化。
研究结果：实验表明，单剂量的TLD-in-DcNP在动物体内表现出了长时间的药效，药物浓度能维持四周之久，远超预期的病毒抑制水平。所有药物在24小时内达到血浆中的最高浓度。与传统的溶解型TLD相比，TLD-in-DcNP大幅提高了药物的体内暴露量和作用时间。此外，该配方可能更加专注于细胞内药物传递，显示出更高的细胞内药物浓度。
研究结论：该研究证明了TLD-in-DcNP的独特配方能够在动物体内保持长时间的药效，为HIV治疗提供了一种便捷、全面且长效的新方案，具有开展临床开发的巨大潜力。
引言：
作为世界卫生组织推荐的首选一线治疗方案，三种HIV口服药物——替诺福韦、拉米夫定和多替拉韦（统称为TLD），在HIV感染者中非常有效，但前提是患者需要持续服用以保持血浆中病毒水平不可检测。问题在于，长期服用TLD药片可能导致患者感到厌倦，一旦中断服药，就会增加病毒反弹和艾滋病进展的风险。
另一种治疗方案是卡贝努瓦注射剂，它结合了卡博特韦和利匹韦林两种长效药物。虽然卡贝努瓦的使用包括先进行一个月的日常服药，以确保病毒得到有效抑制，然后再开始每月或每两月一次的肌肉注射，但这种方法在实际应用中遇到了不少挑战。此外，卡贝努瓦不能覆盖乙型肝炎病毒，因此对于同时感染HIV和HBV的患者来说，并不是一个合适的治疗选项。
在我们先前成功地将水不溶性和水溶性HIV药物与生物相容的脂质辅料结合，以形成所谓的药物组合纳米颗粒（DcNP平台）的基础上，我们进一步探索了将短效的TLD转变为一种单一长效配方的可能性，该配方中替诺福韦（TFV）还具有对乙型肝炎病毒（HBV）的治疗效果。
我们通过两种脂质辅料将TLD药物组合稳定在悬浮液中，形成了一种名为TLD-in-DcNP的注射用药物。在非人类灵长类动物的测试中，这种候选药物展现了显著的长效药代动力学特性。我们的研究表明，长效TLD可以采用DcNP剂型来制备，一次皮下注射后，能够在非人类灵长类动物体内维持所有三种HIV药物长达四周的稳定浓度。
材料与方法：
化学品
我们使用的替诺福韦/TFV PMPA、拉米夫定/3TC和多替拉韦/DTG均来自印度的Laurus和Cipla公司，质量达到cGMP标准。德国Lipoid GmbH公司提供了cGMP级的DSPC和mPEG2000-DSPE。
制备方法
TLD-in-DcNP注射悬浮液是依据先前的方法制备的，但我们对其进行了一些调整。具体包括将5.66毫摩尔的DTG和5.97毫摩尔的HCl与40.27毫摩尔的DSPC以及4.49毫摩尔的mPEG2000-DSPE溶解在472毫升的乙醇中（温度70摄氏度），然后加入含5.85毫摩尔TFV和5.85毫摩尔3TC的200毫摩尔NaHCO3缓冲液。
接着，将此溶液通过控制溶剂去除过程的喷雾干燥方法（使用比利时ProCepT公司的4M8Trix设备）转化为TLD-in-DcNP粉末。此粉末被悬浮在0.45% w/v NaCl和20毫摩尔NaHCO3缓冲溶液中，并在75摄氏度下进行均质化（使用加拿大Avestin公司的Emulsiflex-C5设备），以获得50-70纳米大小的稳定颗粒。
悬浮液随后被冷却至25摄氏度并储存于4摄氏度。通过200倍超量体积的平衡透析测得，TLD与DcNP的关联度分别为21.5%的T，15%的L和95%的D。最终，我们获得了适用于非人类灵长类动物的TLD-in-DcNP（52 ± 5纳米）无菌悬浮液。
药代动力学研究：
在经过官方批准的动物护理和使用委员会指导下，我们纳入了七只体重在7-12公斤的非人类灵长类动物（Macaca nemestrina）进行研究。其中五只动物接受了每千克体重6.2、5.1、10毫克的TLD-in-DcNP注射，另外两只动物则接受了自由混合的TLD注射，这些注射都是通过背部肩胛骨中部的皮下途径进行的。
我们在0到4周的时间内（具体时间点为0、0.25、0.5、1、3、5、8、24、48、120、168、192、336、504、672小时）收集了TLD-in-DcNP组的血液样本，用于药物分析；而自由TLD组的样本收集时间与之相同，但只持续到120小时。在接受TLD-in-DcNP的四只动物中，在48小时和168小时的血液样本中，我们分离并立即冷冻了外周血单核细胞（PBMC）以避免药物损失，并对其进行了药物含量分析。
对于TFV和3TC，我们只能测量其总含量（包括母体药物及其代谢物），因为无法在色谱柱中区分三磷酸盐。所有三种药物在细胞和血浆中的含量都是通过一种已经发表并验证过的LC-MS/MS测定法分析的，该方法已针对TLD的特定质谱（m/z）进行了调整。
根据5毫升的注射量，我们记录了DTG、TFV和3TC的最低定量限/最低检出限分别为0.25/0.08纳克/毫升、0.59/0.2纳克/毫升和0.49/0.16纳克/毫升。
我们采用MATLAB2023a软件进行了非区室药代动力学分析。通过梯形规则对时间与浓度曲线进行积分计算，我们得出了每个动物的药物达峰时间、最高浓度（Cmax）、第四周浓度（C4w）、表观终末半衰期以及直至第四周的曲线下面积（AUC），并以平均值 ± 标准差的形式报告。
由于样品质量问题，NHP#5的PBMC中DTG测定和NHP#7血浆中自由DTG的数据未达到质量标准，因此没有被纳入最终分析。为了评估药物的抗病毒效果，我们进行了体外HIV-1抑制实验，以估算90%抑制药物浓度（IC90）。此实验按照先前描述的方法进行，在有血清蛋白的条件下完成。
对于TLD-in-DcNP和自由混合TLD（以固定剂量比例），我们分别确定了TFV、3TC和DTG的IC90为0.3纳克/毫升、0.2纳克/毫升和0.25纳克/毫升，发现自由组合和DcNP组合之间在抑制效果上相似。
研究结果：
经过对DSPC和mPEG2000-DSPE脂质辅料的系统研究，我们成功地在DcNP纳米悬浮液中稳定了具有不同水溶性（TFV、3TC、DTG：对数P值分别为≤3.4、≤1.3、2.4）的三种HIV药物TLD。最终的TLD-in-DcNP悬浮液含有每千克体重6.2、5.1、10毫克的TLD，以及每毫升115.1、45.8毫克的DSPC和mPEG2000-DSPE。
在使用TLD-in-DcNP和自由状态下的TLD时，我们没有观察到任何关于NHP安全性的问题，包括注射部位的反应。通过皮下给药，我们测定了血浆和PBMC中的药物浓度：在为期4周的NHP研究中，[TFV]、[3TC]和[DTG]始终可以在血浆中检测到（见图1a）。
相比之下，接受自由TLD剂量的NHP的血浆药物水平在3天内降至不可检测的水平。TLD-in-DcNP的血浆浓度峰值都出现在首日内（见图1b），与等效的自由混合物相当。对于TFV、3TC和DTG，TLD-in-DcNP的AUC分别高出7.0倍、2.1倍和20倍（见图1b）。DcNP对于TLD的半衰期延长效果显著，与自由溶解的药物组合相比，其分别增加了10倍、8.3倍和5.9倍。所有药物浓度在整个4周研究期间都高于预估的IC90值。
DcNP对提高细胞内TLD的效果非常显著，所有三种药物的平均细胞-血浆比率均大于1（见表1）。在PBMC中，TFV的浓度在48小时和168小时后分别比血浆高出2.2倍和3.1倍。类似地，PBMC中的3TC[总量]浓度比血浆高3倍和15倍。最后，PBMC中的DTG浓度比血浆高29倍和4.1倍（见表1）。
总体而言，这些数据表明，将水溶性的TFV、3TC和水不溶性的DTG结合成单一的TLD-in-DcNP注射剂，可以在NHP体内提供超过可检测、可测量以及预测的IC90水平的4周血浆暴露时间。
之前的研究表明，DcNP技术能够将短效药物组合转换为长效组合。我们利用了水溶性和不溶性药物与两亲性脂质辅料在不同温度下的物理和化学相互作用。
因此，DcNP技术能够稳定不同物理特性的水溶性和不溶性HIV和癌症药物，如洛匹那韦、利托那韦、依非韦伦、多替拉韦或紫杉醇与水溶性的拉米夫定、替诺福韦或吉西他滨（Gemcitabine,HCL）。将多种药物以单一注射悬浮液形式制剂的能力，在HIV长效治疗领域是值得注意的，因为DcNP能够将水溶性的替诺福韦和拉米夫定与水不溶性的DTG转化为长效产品。
结果讨论
包含强效整合酶抑制剂的三种HIV药物作为一种完整的HIV治疗方案，也可能由于更高和更一致的细胞内药物水平而提供持续的病毒抑制。在NHP第1周，所有三种TLD药物的细胞-血浆比率较血浆中的浓度高出3到15倍，显示出可能的同步TLD增强效果。鉴于TFV是目前用于治疗慢性HBV患者的活跃药物成分（以前药形式为TAF或TDF），TLD-in-DcNP可能为HBV和HIV-HBV共感染患者提供抗病毒保护。
为了抑制病毒复制，替诺福韦（TFV）和拉米夫定（3TC）在细胞内磷酸化为活性代谢物（TFV-dP和3TC-tP）。在之前的研究中，我们报告了使用DcNP技术，从非人类灵长类动物（NHP）分离出的外周血单核细胞（PBMCs）中，约60-70%的细胞内总TFV浓度以TFV-dP形式存在，而40%的3TC以3TC-tP形式存在。
这些数据与口服TDF和3TC报道的数据类似。尽管尚未直接测量，但很可能使用DcNP配制的3TC和TFV在PBMCs中是生物活性的，其活性代谢物的比例与口服剂量相似。
研究发现，血清中TLD组合药物达到90%抗病毒效果所需的目标浓度（IC90）在DcNP与自由溶解配方之间相似。在血清蛋白的条件下估算得出的IC90值为0.2至0.3纳克/毫升（见图1a）。TLD的IC90是基于固定剂量组合的，这个数值可能远低于每种药物单独使用时根据蛋白质调整后的IC90。
举个例子，单独使用DTG的IC90为64纳克/毫升，而在TLD配方中，我们发现其IC90仅为0.25纳克/毫升。另外，将NHP和人类之间DTG的口服剂量标准化暴露（AUC/剂量）进行比较，我们发现由于NHP中DTG的UGT代谢清除率较高，可能会导致人类中DTG的暴露量增加24倍。因此，考虑到在NHP中使用的10毫克/千克剂量，我们观察到的药物浓度可以放大到适合人类治疗的范围内。
我们之前的研究显示，DcNP配方中的药物并不会在注射部位形成局部药物储存。相反，这些药物会被淋巴系统迅速且完全吸收，这与通过血液毛细血管系统的吸收方式不同。DcNP让药物更倾向于渗透到淋巴系统中，而非较难渗透的血管，这是皮下给药后药物首次通过的途径；注射部位没有显著的药物残留。
很可能在TLD-in-DcNP中的所有药物都仍然与DcNP颗粒紧密相关，这有助于增强药物在体内的稳定性，从而为所有药物提供长效的药代动力学特性。早期的研究表明，含洛匹那韦/利托那韦的TFV-in-DcNP通过静脉注射进入体循环后，超过90%的TFV仍然与DcNP相关联。
因此，我们观察到的药物浓度峰值以及随后的持续水平很可能是由于淋巴系统的“首次通过”吸收、细胞内的摄取和保留，以及药物配方在体内的稳定性共同作用的结果。
综合来看，将短效TLD转换为长效的TLD-in-DcNP可能提供了一种全面的、长效的、首选的完整HIV治疗方案。这种创新的方法通过使用脂质稳定的药物组合悬浮液，实现了延长的药代动力学、增强的AUC和在PBMC中的增加浓度。通过调整剂量，这种新型的一体化三药组合为长效HIV治疗提供了新的可能性，有望改变HIV以及HIV-HBV共感染者的生活。
注释：
TLD: 这是指包含三种药物的组合：Tenofovir (T)，Lamivudine (L) 和 Dolutegravir (D)。这是一种用于治疗HIV的药物组合。
HIV: Human Immunodeficiency Virus，即人类免疫缺陷病毒。这是一种通过影响人体免疫系统而导致艾滋病（AIDS）的病毒。
HBV: Hepatitis B Virus，即乙型肝炎病毒。这是一种影响肝脏的病毒，可以导致急性或慢性肝炎。
DcNP: Drug-combination Nanoparticles，即药物组合纳米颗粒。这是一种用于提高药物稳定性和效果的技术，通过将药物与纳米颗粒结合来改进其释放和分布。
AUC: Area Under the Curve，即曲线下面积。在药代动力学中，这是用来衡量药物在体内的总暴露程度的一个指标。
PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cells，即外周血单个核细胞。这些是血液中的一种细胞类型，通常用于医学和生物学研究。
IC90: Inhibitory Concentration 90%，即90%抑制浓度。这是一种衡量药物抗病毒效力的指标，表示需要多少药物浓度才能抑制90%的病毒活性。